Dag 4

Efter att Dag 3 ägnats åt alla förberedande steg av en Southern Blot var det under Dag 4 dags att avsluta processen och analysera resultatet.



Det står klart att vårt preparat innehållit insertet LL37, eftersom vår probe var tillverkad specifikt för att binda till just denna sekvens. Hade proben bundit ospecifikt skulle vi sett färg i de tomma kolumner där DNA-markörerna fanns, alternativt över hela pappret om prehybridiseringen misslyckats.

Trots att denna process gav oss ett mer otvetydigt resultat än PCR, lutar jag dock åt PCR som den mer generellt användbara metoden. Båda innehåller trots allt många steg som kan gå fel, och resultatet hade lika gärna kunnat bli det motsatta. Risken att PCR-provet ska innehålla en annan DNA-sekvens som primers lyckats ospecifikt binda till och som råkar vara av ungefär rätt storlek är inte särskilt stor, så även om det finns en fördel med en specifik probe är den i allmänhet inte avgörande. PCR är en såpass mycket snabbare och mindre invecklad metod att den i de flesta fall bör vara förstahandsvalet. Där finns ju också möjligheten att kvantifiera genom realtids-PCR. Båda metoderna är dock mycket bra för att detektera även mycket små mängder av den sökta DNA-sekvensen.

Det viktigaste jag lärt mig under denna fyradagarslaboration är dels betydelsen av tidsplanering, speciellt när många olika steg innehåller väntetider, dels hur lätt ett misstag kan förstöra allt och hur viktiga noggrannhet och försiktighet alltså är. Rent praktiskt kan förstås också nämnas att jag lärt mig hur inmärkning av en probe går till.

Dag 2

Dag 2 ägnades främst åt att via PCR kontrollera ifall vår plasmid-DNA faktiskt innehöll insertet LL37. Provet amplifierades, och genomgick en elektrofores i agarosgel. Resultatet blev inte som önskat - visserligen syntes ett tydligt band på rätt ställe i den kolumn där vi laddat vårt DNA, men även den negativa kontrollen visade ett band där. Detta band var såpass mycket svagare att det är frestande att säga att trots detta exempel på en carry-over kontamination kan man anta att provet faktiskt innehöll LL37. Hade det gällt ett patientprov hade resultatet dock varit oanvändbart.

Källan till vår carry-over kontamination var relativt lätt att identifiera efter någon minuts fundering. Vi hade helt enkelt inte använt filterspets vid pipettering av vattnet ner i den negativa kontrollen. En diskussion hade tidigare ägt rum om huruvida denna pipettering skulle ske i det rena rummet, eller där vi tillsatte vårt plasmidpreparat till det egentliga provet. Jag vidhåller att det är bättre att det sker under samma förhållanden; även plasmidpreparatet tillsattes ju utan filterspets (eftersom ingen sådan fanns på det ställe vi befann oss, och ingen av oss tänkt på att ta med oss några) och en carry-over i bara det provet hade ju gett ett falskt positivt resultat samtidigt som den negativa kontrollen då hade varit carry-overfritt och alltså indikerat att resultatet var korrekt.

Dag 1

Under laborationens första dag skulle plasmid-DNA med genen LL37 renas fram ur en kultur bestående av rekombinanta E.coli. Den bakteriesuspension vi fick genomgick lysering, alkalisk denaturering, och rening på glasfiberkolonn, vilket (förhoppningsvis) skulle rensa bort vatten, proteiner och övrigt celldebris, kromosomalt DNA, och RNA.

En första kontroll gjordes med hjälp av spektrofotometri för att se om absorbansen stämde överens med vad som gäller för DNA. DNA har sin absorbanstopp vid 280 nm, protein vid 260. Vi uppmätte vårt prov till 0,051 A för 260 nm, och 0,025 A vid 280 nm. Detta ger en kvot på 0,051 / 0,025 = 2,04. Detta är inte ett perfekt resultat - standardkvot för DNA ligger på 1,8 - men allt från 1,6 till 2,0 anses nära nog för att vara acceptabelt. Vårt resultat ligger i överkant vilket innebär att det inte lär vara protein som påverkar, eftersom detta skulle ge ett högre värde vid 280 nm och alltså en lägre kvot. Man kan dock inte vara helt säker på att provet innehöll rent plasmid-DNA, eftersom kromosomalt DNA skulle ge samma resultat i en spektrofotometer. Därför fortsätter kontrollen under Dag 2 med andra metoder.

Blogg här

Här ska bloggas om rening av plasmid-DNA för kursen Molekylärbiologi och molekylärbiologisk metodik.